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液质联用

LC-MS基本原理

LC-MS

LC高效液相色谱是以高压驱动,以液体作为流动相的一种色谱分析方法,它分离效率高,分析速度快,应用范围广,是目前最常用的一种分离分析方法。

MS质谱法是先将物质离子化,按离子的质荷比分离,然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。

液相色谱质谱联用将液相色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来,实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。同时简化了样品的前处理过程。

 

LC-MS基本概念

质荷比: 离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值,写作m/Z

: 质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰。

离子丰度: 检测器检测到的离子信号强度。

基峰: 在质谱图中,指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰。

 

总离子流图:

在选定的质量范围内,所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图,也称TIC.

 

质量色谱图

指定某一质量(或质荷比)的离子其强度对时间所作的图.

利用质量色谱图来确定特征离子,在复杂混合物分析及痕量分析时是LC/MS测定中最有用的方式。当样品浓度很低时LC/MSTIC上往往看不到峰,此时,根据得到的分子量信息,输入M+1M+23等数值,观察提取离子的质量色谱图,检验直接进样得到的信息是否在LC/MS上都能反映出来,确定LC条件是否合适,以后进行MRM等其他扫描方式的测定时可作为参考。

 

准分子离子

指与分子存在简单关系的离子,通过它可以确定分子量。液质中最常见的准分子离子峰是[M+H]+ [M-H]-

ESI, 往往生成质量大于分子量的离子如M+1,M+23,M+39,M+18......称准分子离子,表示为:[M+H]+,[M+Na]+等碎片离子;

准分子离子经过一级或多级裂解生成的产物离子。碎片峰的数目及其丰度则与分子结构有关,数目多表示该分子较容易断裂,丰度高的碎片峰表示该离子较稳定,也表示分子比较容易断裂生成该离子。

 

多电荷离子:

指带有2个或更多电荷的离子,常见于蛋白质或多肽等离子.有机质谱中,单电荷离子是绝大多数,只有那些不容易碎裂的基团或分子结构-如共轭体系结构-才会形成多电荷离子.它的存在说明样品是较稳定的。采用电喷雾的离子化技术,可产生带很多电荷的离子,最后经计算机自动换算成单质荷比离子。

 

同位素离子

由元素的重同位素构成的离子称为同位素离子.

各种元素的同位素,基本上按照其在自然界的丰度比出现在质谱中,这对于利用质谱确定化合物及碎片的元素组成有很大方便, 还可利用稳定同位素合成标记化合物,:氘等标记化合物,再用质谱法检出这些化合物,在质谱图外貌上无变化,只是质量数的位移,从而说明化合物结构,反应历程等

 

LC-MS仪器结构

 

 

离子源

使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子(离子)的装置,根据离子化方式的不同,有机质谱中常用的有如下几种,其中EIESI最常用。

EI(Electron Impact Ionization):电子轰击离子源—硬电离。

CI(Chemical Ionization):化学电离源—核心是质子转移。

FD(Field Desorption):场解吸—目前基本被FAB取代。

FAB(Fast Atom Bombardment):快原子轰击离子源—或者铯离子 (LSIMS,液体二次离子质谱 )

ESI(Electrospray Ionization):电喷雾离子源—属最软的电离方式。适宜极性分子的分析,能分析小分子及大分子(如蛋白质分子多肽等)

APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization):大气压化学电离源—同上,更适宜做弱极性小分子。

APPI(Atmospheric Pressure PhotoSpray Ionization):大气压光喷雾电离源—同上,更适宜做非极性分子。

MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption):基体辅助激光解吸电离源。通常用于飞行时间质谱和FT-MS,特别适合蛋白质,多肽等大分子. 其中ESIAPCIAPPI统称大气压电离(API)

 

ESI:电离过程是由电场产生带电液滴,然后通过离子蒸发生成待分析离子。雾化通常通过气动辅助。

电喷雾(ESI)的特点

通常小分子得到[M+H]+ ]+,[M+Na]+ [M-H]-单电荷离子,生物大分子产生多电荷离子,由于质谱仪测定质/荷比,因此质量范围只有几千质量数的质谱仪可测定质量数十几万的生物大分子。

电喷雾电离是最软的电离技术,通常只产生分子离子峰,因此可直接测定混合物,并可测定热不稳定的极性化合物;其易形成多电荷离子的特性可分析蛋白质和DNA等生物大分子;通过调节离子源电压控制离子的碎裂(源内CID)测定化合物结构。

 

APCI:气态化学电离(CI)过程。溶剂或反应气在电晕针的作用下先带电,再转移给化合物形成离子。

大气压化学电离(APCI)特点

大气压化学电离也是软电离技术,只产生单电荷峰,适合测定质量数小于2000Da的弱极性的小分子化合物;适应高流量的梯度洗脱/高低水溶液变化的流动相;通过调节离子源电压控制离子的碎裂。

 

ESIAPCI的比较



 

ESI

ò离子在溶液中以已生成

ò化合物无需具有挥发性

ò是分析热不稳定化合物的首选

ò除了生成单电荷离子之外还可以生成多电荷离子

APCI

J离子在气态条件中生成

J化合物需具有一定的挥发性

J化合物必需是热稳定的

J只生成单电荷离子



 

 

质量分析器的介绍

双聚焦扇形磁场-电场串联仪器(sector): 通过磁场和电场来传输和选择离子

四极质谱仪(Q): 被分析离子由DCRF电压控制

飞行时间质谱仪(TOF):

所有离子一同起跑,质量小的跑得快时间分辨

离子阱质谱仪(TRAP:离子被RF & DC 电场所储存/扫描电场可以释放特定的m/z离子

付利叶变换-离子回旋共振质谱仪(FT-ICRMS).

 

                             ┏四极+TOFQ-TOF

串列式多级质谱仪┫三重四极(QqQ

       (MS/MS)       TOF+TOF

 

我们重点介绍QQQ——三重串联四级杆质谱系统

QQQQqQ仪器可以方便的改变离子的动能,因此扫描速度快,体积小,常作为台式进入常规实验室,缺点是质量范围及分辨率有限,不能进行高分辨测定,只能做到单位质量分辨。

 

串联四极杆液质联用的特点

  • 高灵敏度(适合复杂基体中低浓度化合物的分析)
  • 高选择性
    •  
  • 快速, 实现高通量分析
  • 定量分析与定性确证一次完成

几种扫描方式介绍:

全扫描方式TICQ1扫描)

  全扫描数据采集可以得到化合物的准分子离子,从而可判断出化合物的分子量,用于鉴别是否有未知物,并确认一些判断不清的化合物,如合成化合物的质量及结构。

 

选择离子扫描SIMQ1扫描)采集某种特征离子碎片

 

子离子分析( MS/MS

    子离子,用于结构判断(得到化合物的二级谱图即碎片离子)和选择离子对作多种反应监测(MRM)。

 

  子离子谱图与锥体电压断裂谱图(源内CID)可能十分相似,所不同的是子离子质谱图已知只有一种质量通过MS1,因此也已知所有碎片离子都是由我们所选定的母离子所产生的,所以我们更相信由MS/MS产生的谱图的纯度。