你在这里

毛细管电泳

毛细管电泳基本原理

 

电泳:在电解质溶液中,位于电场中的带电离子在电场力的作用下,以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象,称之为电泳(electrophoresis)。由于不同离子所带电荷及性质的不同,迁移速率不同,可实现分离。

毛细管电泳CE统指以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。

CEHPLC的比较:毛细管电泳柱效比高效液相色谱更高,操作简单、成本低、分离速度快,尤其适合大分子分离分析。但在迁移时间重现性、进样准确性、检测灵敏度方面逊于HPLC

 

毛细管电泳的基本理论

一、电泳法的基本原理

当带电粒子以速度υ在电场中移动时,所受到的电场力为:

FE=qE FE-电场力;q-溶质粒子所带的有效电荷;E-电场强度。)

带电粒子运动时所受的阻力,即为摩擦力,

        F=fυ   F-摩擦力;f-摩擦系数;υ-溶质粒子在电场中的迁移速度。)

当平衡时,电场力和摩擦力相等而方向相反,

           qE

所以  υqE/f=qE/6πrη (球状粒子)

or      υqE/f=qE/4πrη  (棒形粒子)(r-表观液态动力学半径;η-介质粘度。)

因为ξe=q/εr,用荷电粒子的zeta电势来表示:

        υεξe E/6πη(球状粒子)           υεξe E/4πη(棒形粒子)

由此可见,荷电粒子在电场中的迁移速度,除了与电场强度和介质特性有关外,还与粒子的有效电荷及其大小和形状有关。因此,粒子的大小与形状,以及其有效电荷的差异,就构成电泳分离的基础。

因为电泳速度与外加电场强度有关,所以,在电泳中常用淌度(mobilityμ而不用速度来描述荷电粒子的电泳行为与特性。电泳淌度(μep定义为单位场强下离子的平均电泳速度,即 μep =υ/E

 

 

二、电渗流

当固体与液体相接触时,如果固体表面因某种原因带一种电荷,则因静电引力使其周围液体带另一种电荷,在固液界面形成双电层,二者之间有电势差。当液体两端施加电压时,就会发生液体相对于固体表面的移动。把这种液体相对于固体表面移动的现象叫电渗现象。 电渗现象中液体的整体流动叫电渗流(electro osmotic f1ow,简称EOF)。

毛细管电泳分离的一个重要特性是毛细管内存在电渗流。电渗流的来源如图所示。

1.电渗流的大小和方向

电渗流υeo的大小:  υeoeoE

电渗淌度μeo:  μeooεζ/η

εo-真空介电常数;ε-电泳介质的介电常数;ζ-毛细管壁的zeta电势,它近似等于扩散层与吸附层界面上的电位。

在实际电泳分析中,电渗流速度υeo可通过实验测定:

      υeol/teo

式中,l-毛细管的有效长度;teo-电渗流标记物(中性物质)从进样端迁移至检测器的时间。

电渗流的方向决定于毛细管内壁表面电荷的性质。当缓冲液的pH3以上,石英管壁上的硅醇基(Si-OH)离解生成阴离子(Si-O-),使表面带负电荷,它又会吸引溶液中的正离子,形成双电层,从而在管内形成一个个紧挨的“液环”。在强电场作用下,它自然向阴极移动,形成了电渗流。电渗流迁移率大小与缓冲液的pH值高低及离子强度有密切关系。pH值越高,电渗流迁移率越大;离子强度越高,电渗流迁移率反而变小;在pH920mmol·L-1的硼酸盐缓冲液中,电渗流迁移率的典型值约为2mm·s-1pH值越小,硅醇基带的电荷越少,电渗流迁移率越小;pH值越大,管壁负电荷密度越高,电渗流迁移率越大。若在管内壁涂上合适的物质或进行化学改性,可以改变电渗流的迁移率。例如蛋白质带有许多正电荷取代基,会紧紧地被束缚于带负电荷的石英管壁上,为消除这种情况,可将一定浓度的二氨基丙烷加入到电解质溶液中,此时以离子状态存在的+H3NCH2CH2CH2NH3+,起到中和管壁电荷的作用。也可通过硅醇基与不同取代基发生键合反应,使管壁电性改变。

2.渗流的流型

由于毛细管内壁表面扩散层的过剩阳离子均匀分布,所以在外电场力驱动下产生的电渗流为平流,即塞式流动。液体流动速度除在管壁附近因摩擦力迅速减小到零以外,其余部分几乎处处相等。这一点和HPLC中靠泵驱动的流动相的流型完全不同,图中表示HPCE中电渗流与HPLC中流动相的流型及它们对区带展宽的影响。

图5-4电渗流和高效液相色谱的流型(上图)及相应的溶质区带(下图)

            A.电渗流;       B.高效液相色谱中的流型

在外加强电场之后,正离子向阴极迁移,与电渗流方向一致,但移动得比电渗流更快。负离子应向阳极迁移,但由于电渗流迁移率大于阴离子的电泳迁移率,因此负离子慢慢移向阴极。中性分子则随电渗流迁移。一般情况下,电渗流速度约等于一般离子电泳速度 的57倍。可见正离子、中性分子、负离子先后到达检测器。实验证明,不电离的中性溶剂也在管内流动,因此利用中性分子的出峰时间可以测定电渗流迁移率的大小。

因此,电渗流在HPCE中起泵的作用,在一次CE操作中同时完成正负离子的分离分析,而电渗流的微小变化会影响CE分离测定结果的重现性,改变电渗流的大小或方向可改变分离效率和选择性。

3.毛细管电泳柱效率

CE中的分离效率用理论塔板数N表示,其理论表达来源于色谱理论,用Giddings方程定义为:

        N=l22

式中l-有效长度,σ-区带中浓度分布的方差。

在理想CE中,(1)毛细管中的流液为平流,即塞式流动,溶质在柱中的径向扩散几乎完全忽略;(2)毛细管本身具有抗对流性,对流引起的峰加宽不明显;(3)没有或很少有溶质与管壁间的相互吸附作用,忽略吸附引起的加宽作用。此时,可认为溶质的纵向扩散是高效毛细管电泳中引起溶质峰加宽的唯一因素,这相当于色谱速率理论中的第二项即分子扩散项对板高的影响,则:

σ2=2Dt            (D-溶质的扩散系数)

t=l/υeo=l/μeoE

N=μeoE l/2D

由此看出,(1)表观电渗淌度大,工作电压大,扩散系数小,都可使N大,分离效率高;(2)在相同电流条件下,扩散系数小的溶质比扩散系数大的溶质的分离效率高,即扩散引起的峰加宽较小,分离效率较高。这就是HPCE能高效分离生物大分子(如蛋白质、核酸等)的理论依据。

另外,和一般色谱一样,分离效率也可直接从电流图求出,即

N=5.54(t/W1/2)2            or        N=16(t/W)2

4.分离度

  分离度Rs:       Rs=ΔL/W=ΔL/4σ

因为两峰之间的距离(ΔL)正比于两组分的迁移速度之差(Δυ,所以两峰中心之间的距离与两组分迁移距离的平均值(即毛细管的有效长度Lef)之比等于两组分迁移速度的平均值υ)之比。

ΔL/Lef=Δυ/υ

则  Rs= (Lef/4σ)(Δυ/υ)

由 N=( Lef/σ)2        Rs= (N/4)(Δυ/υ)

由于Δυ/υ=Δμ/μ, 相邻两组分的相对速度差等于相邻两组分的相对淌度差

所以  Rs= (N/4)( Δμ/μ)

通常,在电流图上读出两相邻峰的迁移时间和它们的峰宽,可计算Rs

Rs=2(t2-t1)/(W1+W2)

 

仪器结构

  •  
  1. 高压电源:
  • 030 kV 稳定、连续可调的直流电源;
  • 具有恒压、恒流、恒功率输出;
  • 电场强度程序控制系统;
  • 电压稳定性:0.1%
  • 电源极性易转换;

 

  1. 毛细管

 

规格:内径2075μm,外径350400μm;长度<=1m

 

  1. 缓冲液池 化学惰性,机械稳定性好;

 

  1. 检测器

类型          检测限/mol            特点

紫外-可见       10-1310-15    加二极管阵列,光谱信息

荧光            10-1510-17      灵敏度高,样品需衍生

激光诱导荧光    10-1810-20      灵敏度极高,样品需衍生

电导            10-1810-19      离子灵敏,需专用的装置;

 

  1. 进样方式

    电动进样

加压进样

 

毛细管电泳主要分离模式

(1)毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis,CZE,又称毛细管自由电泳,是CE中最基本、应用最普遍的一种模式。前述基本原理即是CZE的基本原理。

(2)胶束电动毛细管色谱(micellar electrokineticcapillary chromatography,MECC,是把一些离子型表面活性剂(如十二烷基硫酸钠SDS)加到缓冲液中,当其浓度超过临界浓度后就形成有一疏水内核、外部带负电的胶束。虽然胶束带负电,但一般情况下电渗流的速度仍大于胶束的迁移速度,故胶束将以较低速度向阴极移动。溶质在水相和胶束相(准固定相)之间产生分配,中性粒子因其本身疏水性不同,在二相中分配就有差异,疏水性强的和胶束结合牢,流出时间就长,最终按中性粒子疏水性不同得以分离。MECC使CE能用于中性物质的分离,拓宽了CE的应用范围,是对CE极大的贡献。

(3)毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis,CGE)是将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。凝胶具有多孔性,起类似分子筛的作用,溶质按分子大小逐一分离。凝胶粘度大,能减少溶质的扩散,所得峰形尖锐,能达到CE中最高的柱效。常用聚丙烯酰胺在毛细管内交联制成凝胶柱,可分离、测定蛋白质和DNA的分子量或碱基数,但其制备麻烦,使用寿命短。如采用粘度低的线性聚合物如甲基纤维素代替聚丙烯酰胺,可形成无凝胶但有

筛分作用的无胶筛分(Non-Gel Sieving)介质。它能避免空泡形成,比凝胶柱制备简单,寿命长,但分离能力比凝胶柱略差。CGE和无胶筛分正在发展成第二代DNA序列测定仪,将在人类基因组计划中起重要作用。

(4)毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing,CIEF)将普通等电聚焦电泳转移到毛细管内进行。通过管壁涂层使电渗流减到最小,以防蛋白质吸附及破坏稳定的聚焦区带,再将样品与两性电解质混合进样,两端贮瓶分别为酸和碱。加高压(6~8kV3 5min后,毛细管内部建立pH梯度,蛋白质在毛细管中向各自等电点聚焦,形成明显的区带。最后改变检测器末端贮瓶内的pH值,使聚焦的蛋白质依次通过检测器而得以确认。

(5)毛细管等速电泳(capillary isotachorphoresis,CITP)是一种较早的模式,采用先导电解质和后继电解质,使溶质按其电泳淌度不同得以分离,常用于分离离子型物质,具有富集浓缩作用。

(6)毛细管电色谱(capillary electrochromatography,CEC)是将HPLC中众多的固定相微粒填充到毛细管中,以样品与固定相之间的相互作用为分离机制,以电渗流为流动相驱动力的色谱过程,虽柱效有所下降,但增加了选择性。

(7)毛细管微乳电动色谱(Microemulsion electrokinetic chromatography, MEEKC)